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Fundación Ramón Areces

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Ciencias de la Vida y de la Materia

Aplicación de análisis genéticos en la creación de bancos de germoplasma en teleósteos

Investigadora Principal:
Vanesa Robles Rodríguez 

Centro de Investigación: 
Departamento de Biología Molecular e Instituto de Desarrollo Ganadero y Sanidad Animal (INDEGSAL). Universidad de León.

Sinopsis: 
Vanesa Robles La creación de bancos de germoplasma es una herramienta de inestimable valor para la preservación de la diversidad genética, con fines de conservación, y para la industria de la piscicultura. En teleósteos, la fuente celular utilizada para estos fines han sido tradicionalmente los espermatozoides. En este proyecto se han planteado tres objetivos dirigidos a mejorar la creación de bancos de germoplasma en teleósteos y los tres han tenido un grado de consecución del cien por cien. Se han utilizado dos especies de teleósteos: dorada (como especie de gran interés comercial) y pez cebra (como especie modelo). En esta última especie, se ha propuesto ensayar la criopreservación de células primordiales germinales como fuente celular alternativa para la creación de bancos de germoplasma, puesto que su criopreservación garantizaría el mantenimiento tanto del genoma materno como paterno.

El primer objetivo de este proyecto perseguía encontrar marcadores que permitieran realizar un diagnóstico molecular de la calidad espermática de los reproductores. Se han encontrado 7 transcritos que en células testiculares de pez cebra presentan una expresión diferencial en buenos y malos reproductores y 3 transcritos presentes diferencialmente en espermatozoides de reproductores de dorada con alta y baja motilidad (valorada con el método CASA). Es altamente probable que estos marcadores encontrados tengan un elevado valor en las técnicas reproductivas y en la preselección de muestras destinadas a criopreservación. De hecho, tener disponibles dichos marcadores ha permitido realizar un estudio sobre el efecto de la alimentación con probióticos sobre la calidad seminal, observando que dichos suplementos incrementan la expresión de algunos de estos genes en células testiculares.

El segundo objetivo planteaba la utilización de la PCR a tiempo real (qPCR) para la cuantificación del número de lesiones producidas por la criopreservación en genes concretos, especialmente en aquellos genes clave en el desarrollo embrionario temprano. Este objetivo se ha logrado con éxito tanto en espermatozoides de dorada como en PGCs de pez cebra, demostrando que esta técnica es altamente sensible y logra cuantificar las lesiones en determinados genes y/o secuencias del genoma tanto mitocondrial como nuclear tras la criopreservación, incluso en aquellos protocolos que no producen fragmentación del DNA (valorado por comet assay) ni acortamiento de telómeros (qPCR). Esta mayor sensibilidad de la técnica permite discriminar entre protocolos de criopreservación indiferenciables por cualquiera de las otras técnicas.

El tercer y último objetivo perseguía analizar la metilación de promotores en genes específicos antes y después de la criopreservación. Este estudio ha permitido concluir que la criopreservación induce hipermetilación en algunos de los promotores génicos estudiados y una disminución, casi generalizada de los transcritos celulares (tanto en PGCs como en células transcripcionalmente inactivas como son los espermatozoides). Este hecho demuestra que la disminución de algunos de los mRNAs no puede ser explicada desde un punto de vista epigenético. Los resultados respaldan la hipótesis de que el proceso de criopreservación (y no la simple incubación en los agentes crioprotectores) pueden hacer los mRNA más susceptibles a la degradación mediante la desestabilización de las uniones mRNA/proteína. Este hecho es especialmente relevante en espermatozoides (células transcripcionalmente inactivas), cuyos mRNA son remanentes de la espermatogénesis y se ha demostrado que en muchas especies juegan un papel clave en la fecundación y desarrollo embrionario temprano, y por tanto han de ser preservados de degradación.

Imagen

PGCs de la línea trasngénica vasa: EGFP viables (trypan blue negativas). Se observa la capacidad de emisión de pseudópodos (flecha) tras la criopreservación.

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Diseño experimental para el estudio sobre el diagnóstico molecular de la calidad espermática en pez cebra (A y B). Expresión relativa (medias ± SE) de células testiculares de pez cebra. El valor 1 representa la expresión en los buenos reproductores para cada gen. Los asteriscos muestran las diferencias significativas (p < 0.05 Student's t test). Se puede observar la represión significativa de 5 de los 11 genes estudiados y la sobreexpresión de 2 en los malos reproductores (C)

Producción científica:

Artículos generados en Revistas 7
Comunicaciones en congresos nacionales 4
Comunicaciones en congresos internacionales 12

Relación de artículos:

  • MF Riesco, F. Martínez Pastor, O. Chereguini, V. Robles: Evaluation of zebrafish (Danio rerio) PGCs viability and DNA damage using different cryopreservation protocols. Theriogenology 77 122-130. 2012
  • Martínez-Pastor, F. and Robles, V: Flow cytometric methods for sperm assessment. Methods Mol Biol.927 175-86. 2012
  • Riesco MF, and Robles V. Quantification of DNA damage by q-PCR in cryopreserved zebrafish Primordial Germ Cells. J. Appl. Icthyol. 2012 28:925-929. 2012
  • Fernando Cartón-García, Marta F. Riesco, Elsa Cabrita, M. Paz Herráez and Vanesa Robles: Quantification of lesions in nuclear and mitochondrial gene of Sparus aurata cryopreserved sperm. Aquaculture 402-403 (2013) 106-112. 2013
  • Guerra SM, García Valcarce D., Cabrita E and Robles V. Analysis of transcripts in gilthead seabream sperm and zebrafish testicular cells: mRNA profile as a predictor of gamete quality. Aquaculture 406-407 (2013) 28-33
  • Labbé, C; Robles V; Herráez MP: Cryopreservation of gametes for aquaculture and alternative cell sources for genome preservation. Advances in aquaculture hatchery technology (Allan and Burnell) Ch 3 woodhead Publishing, actualmente page proofs; 2013
  • Riesco MF. and Robles V: Optimized cryopreservation protocols for gene banking causes genetic and epigenetic alterations. PloS One (aceptado)

Relación de presentaciones en congresos:

  • C Labbé, V. Robles, A. Depincé, M. Riesco, P. Milon, M. Conradt,, P-Y Le Bail, P. Herráez. Insight into the DNA methylation of fish germ cells into the risk of alteration after cryopreservation and possible consequences on embryo development. International Workshop on Biology of Fish Gametes Faro (Portugal) 18-20 septiembre de 2013
  • Riesco MF, Pardo, MA, Cruz Z, García-Valcarce D, Robles V. Evaluation of a probiotic diet on zebrafish sperm quality markers. 4th International Workshop on Biology of Fish Gametes Faro (Portugal) 18-20 septiembre de 2013.
  • Gonzalez-Rojo S., Fernández-Díez C, Martinez-Guerra, S, Robles V, Herráez MP. Sensitivity of developmental key genes to DNA damagin agents in trout spermatozoa. 4th International Workshop on Biology of Fish Gametes Faro (Portugal) 18-20 septiembre de 2013.
  • Riesco MF, Herráez MP, Robles V. Primordial Germ Cells as an alternative source for gene banking in zebrafish.8th European Zebrafish Meeting 2013. Barcelona 9-13 julio 2013
  • Riesco MF, Valcarce DG, Liliana Gutiérrez, Claudia Navarro, Silvia Sevilla, Vanesa Robles. Zebrafish blastomere differentiation to PGC-like cells. Barcelona 9-13 julio 2013
  • Elsa Cabrita, Sonia Martínez-Páramo, Paulo Gavaia, Tiziana Pacchiarini, David G.Valcarce, Carmen Sarasquete, Vanesa Robles. Factors affecting sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Larvi 2013, 6th fish and shellfish larviculture symposium, Ghent University Belgium, 2-5 September 2013
  • Cartón García F, Riesco MF and Robles V. DNA damage quantification in specific genes associated with fertilization and embryo development after human sperm cryopreservation. IX Meeting of the Spanish Society for Developmental Biology (SEBD) Granada 12-14 Noviembre 2012
  • Valcarce DG, Cartón García F, Herráez MP, Robles V. Study of the effect of cryopreservation on human spermtozoa mRNA transcripts considered as potential fertility and pregnancy markers. IX Meeting of the Spanish Society for Developmental Biology (SEBD) Granada 12-14 Noviembre 2012
  • Riesco MF, Valcarce DG and Robles V. An alternative cell source for genebanking in zebrafish: effect of cryopreservation procedures at genetic and epigenetic level IX Meeting of the Spanish Society for Developmental Biology (SEBD) Granada 12-14 Noviembre 2012
  • Riesco MF, Herráez MP, Robles V. Effect of cryopreservation on primordial germ cell (PGC) gene expression. The 4th EMBO meeting, Nice, France, 22-25 septiembre 2012.
  • F. Cartón-García, M.F. Riesco, E. Cabrita, F. Martínez-Pastor, M.P. Herráez, V. Robles. Quantification of DNA damage on specific sequences after gilthead sea bream sperm cryopreservation 49th annual meeting of the Society for Cryobiology, Rosario, Argentina, June 3-6 2012
  • Riesco MF, V. Robles. Quantitative DNA damage evaluation in cryopreserved zebrafish primordial germ cells. Oral communication. 3rd international Workshop on The biology of Fish Gametes. Budapest, Hungary. September 7-8 2011
  • V. Robles Riesco MF, Marrtínez-Pastor F., Herráez MP, Pérez-Cerezales. Evaluation of genetic damage in vitrified zebrafish Primordial Germ Cells. Poster. The 2nd International Congress on Controversies in Cryopreservation of Stem Cells, Reproductive Cells Tissue and Organ. Valencia, Spain. April 7-9, 2011
  • Riesco MF, Marrtínez-Pastor F., Herráez MP, Chereguini O. V. Robles. Vitrification of zebrafish primordial germ cells. Poster. 7th European Zebrafish Meeting. Edinburgh, Scotland. 5-9 July 2011.
  • Martínez-Vázquez R., Martíenz-Pastor F., Herráez MP, Cabrita E., V. Robles. Evaluation of fluorescent stains and flow cytometry for viabiligy assessment of gilthead sea bream (Sparus aurata) spermatozoa. Poster. ESDAR Conference 2011. Antalya, Turkey. 15-17 September 2011
  • Guerra SM., Herráez MP, Martínez-Pastor F., Robles V. The effect of aging in gene expression profile of zebrafish testicular cells: mRNA expression as predictor of fertilization ability. Poster XIV Congreso de la Sociedad Española de Biología Celular Málaga 12-15 de diciembre de 2011.



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