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Proyectos de investigación

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Análisis genómico y transcriptómico para identificar defectos de splicing y evaluación in vivo de la terapia antisentido

Enfermedades raras

Investigador Principal: Lourdes Ruiz Desviat

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Centro de investigación o Institución: Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa". CSIC-Universidad Autónoma de Madrid

Sinopsis

En este proyecto se están aplicando técnicas de secuenciación masiva para realizar un análisis integrado del genoma de pacientes con enfermedades metabólicas hereditarias (EMH) con genotipo incompleto, con objeto de identificar mutaciones intrónicas patológicas que afecten al proceso de splicing. Hemos diseñado un panel de captura de genes para el análisis genético de mutaciones en EMH. Este panel captura la región exómica de 120 genes y la captura de la secuencia completa de 6 genes entre los que están el gen PAH y el gen OTC.

Se han analizado seis pacientes portadores de una sola mutación patogénica en el gen de la PAH (chr12: 103232003-103311463). La cobertura fue del 99% con una cobertura media mínima de 446x (341-817). Tras el filtrado por calidad de secuencia y el alineamiento de las lecturas con la secuencia genómica (hg19) se han identificado una media de 140 SNV de las cuales 135 están en los intrones. Se han seleccionado 10 variantes intrónicas nuevas para su evaluación posterior. Asimismo, se han analizado, mediante un sistema de minigenes, diferentes mutaciones previamente reportadas, con efecto sobre splicing conocido o no, para confirmar el efecto de cada mutación y proporcionar un sistema in vitro para evaluar las estrategias terapéuticas basadas en oligonucleótidos antisentido (AONs) y sobreexpresión de snRNAU1.

Hemos evaluado cinco mutaciones intrónicas, tres en el gen PAH (c.1066-11g>a, c.1199+17g>a y c.1199+20g>c) responsables de fenilcetonuria y dos en el gen HEXB (c.445+1G>A y c.1509-26G>A) causantes de la patología de almacenamiento lisosomal llamada Enfermedad de Sandhoff o Gangliosidosis GM2 tipo II. En todas se confirma un defecto de splicing, bien por creación de un sitio críptico de splicing, o bien provocando la exclusión del exón correspondiente (exon skipping). Esto último se debe a la disrupción del sitio de splicing natural por la mutación o por abolir secuencias potenciadoras de splicing y/o creación de una secuencia silenciadora, según predicen diversos programas bioinformáticos.

Por otra parte, se investiga en estrategias de administración de AONs dirigidos a los defectos de splicing. Recientemente se ha descrito el uso de vectores plasmídicos sin secuencias bacterianas (minicírculos) portadores de fusiones snRNAU7-AON que permiten un efecto duradero de la acción biológica del AON. Hemos clonado la secuencia de un AON que modula el splicing del exon 11 del gen PAH, previamente ensayado con éxito en ratones, en un vector productor de minicírculos, fusionado con el snRNAU7. Tras el clonaje, se transformaron bacterias de la cepa bacteriana ZYCY10P3S2T y se han producido con éxito los minicírculos por inducción con arabinosa. Tras la purificación de los minicírculos, se transfectarán inicialmente en células de hepatoma para analizar el efecto sobre el splicing del gen PAH.

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