Proyectos de investigación

La creación de bancos de germoplasma es una herramienta de inestimable valor para la preservación de la diversidad genética, con fines de conservación, y para la industria de la piscicultura. En teleósteos, la fuente celular utilizada para estos fines han sido tradicionalmente los espermatozoides. En este proyecto se han planteado tres objetivos dirigidos a mejorar la creación de bancos de germoplasma en teleósteos y los tres han tenido un grado de consecución del cien por cien. Se han utilizado dos especies de teleósteos: dorada (como especie de gran interés comercial) y pez cebra (como especie modelo). En esta última especie, se ha propuesto ensayar la criopreservación de células primordiales germinales como fuente celular alternativa para la creación de bancos de germoplasma, puesto que su criopreservación garantizaría el mantenimiento tanto del genoma materno como paterno.

El primer objetivo de este proyecto perseguía encontrar marcadores que permitieran realizar un diagnóstico molecular de la calidad espermática de los reproductores. Se han encontrado 7 transcritos que en células testiculares de pez cebra presentan una expresión diferencial en buenos y malos reproductores y 3 transcritos presentes diferencialmente en espermatozoides de reproductores de dorada con alta y baja motilidad (valorada con el método CASA). Es altamente probable que estos marcadores encontrados tengan un elevado valor en las técnicas reproductivas y en la preselección de muestras destinadas a criopreservación. De hecho, tener disponibles dichos marcadores ha permitido realizar un estudio sobre el efecto de la alimentación con probióticos sobre la calidad seminal, observando que dichos suplementos incrementan la expresión de algunos de estos genes en células testiculares.

El segundo objetivo planteaba la utilización de la PCR a tiempo real (qPCR) para la cuantificación del número de lesiones producidas por la criopreservación en genes concretos, especialmente en aquellos genes clave en el desarrollo embrionario temprano. Este objetivo se ha logrado con éxito tanto en espermatozoides de dorada como en PGCs de pez cebra, demostrando que esta técnica es altamente sensible y logra cuantificar las lesiones en determinados genes y/o secuencias del genoma tanto mitocondrial como nuclear tras la criopreservación, incluso en aquellos protocolos que no producen fragmentación del DNA (valorado por comet assay) ni acortamiento de telómeros (qPCR). Esta mayor sensibilidad de la técnica permite discriminar entre protocolos de criopreservación indiferenciables por cualquiera de las otras técnicas.

El tercer y último objetivo perseguía analizar la metilación de promotores en genes específicos antes y después de la criopreservación. Este estudio ha permitido concluir que la criopreservación induce hipermetilación en algunos de los promotores génicos estudiados y una disminución, casi generalizada de los transcritos celulares (tanto en PGCs como en células transcripcionalmente inactivas como son los espermatozoides). Este hecho demuestra que la disminución de algunos de los mRNAs no puede ser explicada desde un punto de vista epigenético. Los resultados respaldan la hipótesis de que el proceso de criopreservación (y no la simple incubación en los agentes crioprotectores) pueden hacer los mRNA más susceptibles a la degradación mediante la desestabilización de las uniones mRNA/proteína. Este hecho es especialmente relevante en espermatozoides (células transcripcionalmente inactivas), cuyos mRNA son remanentes de la espermatogénesis y se ha demostrado que en muchas especies juegan un papel clave en la fecundación y desarrollo embrionario temprano, y por tanto han de ser preservados de degradación.

PGCs de la línea trasngénica vasa: EGFP viables (trypan blue negativas). Se observa la capacidad de emisión de pseudópodos (flecha) tras la criopreservación.

Diseño experimental para el estudio sobre el diagnóstico molecular de la calidad espermática en pez cebra (A y B). Expresión relativa (medias ± SE) de células testiculares de pez cebra. El valor 1 representa la expresión en los buenos reproductores para cada gen. Los asteriscos muestran las diferencias significativas (p < 0.05 Student's t test). Se puede observar la represión significativa de 5 de los 11 genes estudiados y la sobreexpresión de 2 en los malos reproductores (C)